作者：王笑峰 孙迎娟 罗兵 李慧 王云

【关键词】 HHV6

［摘要］ 目的 探讨人疱疹病毒6型(HHV6)和7型（HHV7）感染在类风湿性关节炎（RA）病因学中作用。方法 用巢式PCR技术，检测62例类风湿性关节炎病人和138例健康献血员外周血单个核细胞（PBMCs）和血浆中HHV6和HHV7 DNA。结果 类风湿性关节炎病人组PBMCs中HHV6和HHV7 DNA阳性率与正常对照组比较均无显著性差异（P>0.05）；部分类风湿性关节炎病人血浆中可检出HHV6和HHV7 DNA，而对照组血浆中则为阴性。结论 类风湿性关节炎病人中可能存在HHV6或HHV7的活动性感染，与类风湿性关节炎的发生发展有一定关系。

［关键词］ 关节炎，类风湿; 疱疹病毒6型，人;疱疹病毒7型，人;巢式聚合酶链反应

RELATIONSHIP BETWEEN HHV6 AND HHV7 INFECTION AND RHEUMATOID ARTHRITISWANG XIAOFENG, SUN YINGJUAN, LUO BING, et al (Department of Microbiology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the role of human herpesvirus 6 and 7 （HHV6, HHV7） infection in the etiology of rheumatoid arthritis （RA）.MethodsHHV6 and HHV7 DNA from the plasma and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were tested with nested PCR in 62 RA patients and 138 matched healthy adult donors. ResultsThe differences of positive rates of HHV6 DNA and HHV7 DNA in PBMCs of the patients were not significant compared with those of the healthy controls (P>0.05); HHV6 and HHV7 & DNA were detected in the plasma of some patients but negative in the plasma of the controls.ConclusionHHV6 and HHV7 DNA are present in the plasma of some RA patients, which suggests that the active infection of HHV6 and HHV7 may be related to the pathogenesis of RA.

［KEY WORDS］rheumatoid arthritis; human herpsvirus 6; human herpsvirus 7; nested polymerase chain reaction

人疱疹病毒6型和7型（HHV6和HHV7）是新近发现的对T淋巴细胞具有高度亲嗜性的新型疱疹病毒，人群中感染十分普遍。原发感染多见于6月～2岁婴幼儿，原发感染后通常以潜伏形式长期存在于宿主体内，在人体免疫力下降或免疫抑制状态下可被激活，导致活动性感染。国内外学者对该病毒与人体免疫功能的相互关系给予了极大关注。类风湿性关节炎（RA）是一种原因不明的自身免疫性疾病，通常认为是由多种因素诱发人体自身免疫反应而致病。有资料表明，某些病毒感染可促进人体自身免疫反应而成为自身免疫性疾病的诱发因素，但有关HHV6和HHV7感染与自身免疫性疾病关系的研究报道不多。本文以RA病人和健康人为研究对象，用巢式PCR检测其外周血细胞单个核细胞（PBMCs）和血浆中HHV6 和HHV7 DNA，进一步探讨HHV6 和 HHV7感染与RA的相关性。

1 材料与方法

1.1 对象

RA病人62例，为2002年10月～2002年12月在青岛大学医学院附属医院内科、骨科和风湿免疫科门诊就诊及住院病人，均符合1992年美国心脏病协会修订的Jones标准。其中男12例，女28例；年龄10～62岁，平均（34.23±14.70）岁。同期选择性别和年龄与之相应的青岛市中心血站健康献血员138例作为对照。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 抽取受试者静脉血4 mL, ACD无菌抗凝， 1 200 r/min离心10 min，吸取中间白膜层,酚氯仿异戊醇法常规提取外周血细胞DNA，同时分离血浆置-20 ℃保存备用。

1.2.2 血浆PCR模板制备 50 μL血浆加50 μL裂解液，煮沸5 min，以8 000 r/min离心5 min，取上清作为PCR 反应模板。

1.2.3 PBMCs中HHV6和HHV7 DNA的检测采用巢式PCR方法。PCR引物设计及巢式PCR反应条件均参照文献 ［1］，引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。引物序列见表1。同时设立阳性对照和阴性对照，HHV6阳性对照为HHV6标

表1 巢式PCR引物序列（略）

取PCR产物10 μL，20 g/L琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L EtBr）中电泳，80 V、1 h，紫外线透射仪下观察结果。HHV6外侧PCR扩增产物为287 bp，内侧PCR扩增产物为163 bp；HHV7外侧PCR扩增产物为186 bp，内侧PCR扩增产物为124 bp。

1.2.4 限制性酶切分析 取HHV6、HHV7内侧PCR阳性扩增产物分别用HindⅢ和 EcoRⅠ进行限制性内切酶分析。酶切产物于120 g/L聚丙烯酰胺凝胶中电泳，80V、90 min，凝胶用EtBr（0.5 mg/L）染色20 min。紫外线透射仪下观察结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS四格表卡方检验。

2 结 果

2.1 HHV6 DNA检测RA病人PBMCs中有34例HHV6 DNA阳性，阳性率为54.84%；对照组PBMCs中有73例HHV6 DNA阳性，阳性率为52.90%（见图1）。两组 HHV6 DNA阳性检出率差异无显著意义（χ2=0.002，P>0.05）。34例PBMCs HHV6阳性RA病人血浆中23例检测出HHV6 DNA ，阳性率为37.10%，而对照组血浆中未发现HHV6 DNA阳性者。

2.2 HHV7 DNA检测

RA病人PBMCs中有38例HHV7 DNA阳性，阳性率为61.29%；对照组PBMCs中有80例HHV6 DNA阳性，阳性率为57.97%（见图1）。两组HHV7 DNA阳性检出率差异无显著意义

图1 部分标本PBMCs中HHV6、HHV7 DNA 内侧 PCR检测结果

2.3 PCR产物的限制性酶切分析

HHV6内侧PCR阳性扩增产物（163 bp），经限制性核酸内切酶Hind Ⅲ酶切后可观察到两种情况，HHV6A酶切产物为 66 bp和97 bp 两条带，而HHV6B不被消化仍为163 bp的内侧PCR扩增条带。RA病人组34例HHV6阳性者中，有30例病人为HHV6B型（88.24%），有4例为HHV6A型（11.76%）；73例HHV6阳性正常对照者中HHV6A型占17.81%（13/73），HHV6B型占82.19%（60/73）。RA病人组与正常对照组HHV7内侧PCR阳性扩增产物（124 bp）经限制性内切酶EcoRⅠ消化后均出现79 bp和54 bp两条带，证明为特异性扩增条带。

3 讨 论

HHV6和HHV7是两种普遍存在的人类疱疹病毒，均属β疱疹病毒亚科，具有高度的T淋巴细胞亲嗜性，而且两者具有较高的同源性。HHV6和HHV7原发感染后在人体内长期存在，具有潜伏活动的生物学特征。根据HHV6分离毒株抗原性、感染宿主范围、限制性酶切图谱及其序列分析，将HHV6分为两组,即人疱疹病毒6型Ａ组和B组。HHV6的原发感染主要为HHV6B感染。有研究提示，HHV6和HHV7与自身免疫性疾病的发生有一定关系，其中CD4分子是HHV6和HHV7重要的受体，SECCHIERO等［6］研究显示，HHV7感染CD4+细胞后，能引起CD4分子下调。HHV6、HHV7与其他病毒如EBV和HCMV 1期王笑峰,孙迎娟,罗兵，等HHV6和HHV7感染与类风湿性关节炎的相关性55可共同导致宿主复合感染、B淋巴细胞多克隆激活，机体免疫功能异常。近年来的研究显示，器官移植和免疫抑制病人HHV6和HHV7检出率明显高于正常人，表明免疫抑制的病人非常容易感染HHV6和HHV7或导致潜伏的病毒激活，HHV6和HHV7的激活又可加重这些疾病的进程［3］。RA是一种全身性T细胞构成和功能紊乱导致的以关节滑膜损伤为主要表现的自身免疫性疾病，其诱因是多方面的。大量研究资料表明，RA与病毒感染有关，EBV感染是RA始动因子，与类风湿沉淀素的产生直接相关，而HHV6、HHV7感染则可反式激活EBV。细胞因子在RA的发病机制中亦发挥着重要的作用，RA病人的血清及关节液中可检测出高水平的IL1和TNFα，IL1是一种促炎细胞因子，尤其是IL1β为RA关节软骨破坏最重要的一种细胞因子。TNFα主要由单核巨噬细胞产生，YOCCUM等［4］认为在RA活动期或进展期，TNF呈高水平分泌，导致一系列临床症状及局部关节组织的破坏，慢性期TNFα水平相对较低且稳定。SAXNE等［5］认为血清中TNFα升高可能提示疾病的活动性或严重性， TNFα与IL1被称为“姊妹细胞因子”，共同起到“中心罪犯”的作用。此外，IL1β和TNFα尚能诱导致炎细胞因子IL6和IL8的产生， 在RA发病中共同发挥作用。已有研究证实，HHV6感染可导致PBMC合成IL2降低，诱导细胞因子IL1β和TNFα的产生，表明HHV6感染在自身免疫疾病中可直接发挥作用。研究证实，健康人PBMC中可检测到HHV6 和HHV7 DNA，且HHV6和HHV7潜伏感染状态可被某些影响因素激活，从潜伏感染病人PBMC中可检出低水平的HHV6和HHV7 DNA［6］。 本研究以RA病人以及健康献血员为研究对象，采用巢式PCR技术检测PBMC中HHV6和HHV7 DNA,提高了检测的敏感性和特异性，结果显示，病人组与对照组HHV6和HHV7阳性率无显著性差异，提示HHV6和HHV7感染与RA无明显相关性，与COOKE等［7］的研究结果相同。病人体内是否存在HHV6和HHV7的复发性激活，疾病的发生发展是否与HHV6和HHV7再激活有关，须确定HHV6和HHV7活动性感染检测指标。SECCHIERO等［8］ 研究表明，血浆、血清和体液中游离HHV6和HHV7 DNA的存在标志着HHV6和HHV7的活动性感染。本文结果显示，部分RA病人血浆中可检测到HHV 6和HHV7 DNA，而对照组为阴性，提示部分病人体内有HHV6和HHV7的活动性感染，其是否与疾病的发生发展相关还有待进一步实验研究。此外，本研究中只有2例RA病人血浆中同时检测出HHV6和HHV7 DNA，这可能由于HHV7感染能激活潜伏状态的HHV6，而HHV6一旦被激活后有优势增殖现象，反而抑制了HHV7的增殖，从而引起一系列与HHV6有关的疾病。深入研究病毒间相互激活的过程，更有助于对疾病的病因学及治疗学的探讨。综上所述，HHV6 和HHV7的活动性感染可能与RA的发生发展有关，HHV6和HHV7活动性感染指标的检测对研究其与疾病的确切关系具有重要意义。有关HHV6和HHV7在RA病因学中的确切作用还有待进一步研究证实。

［参考文献］

［1］BERNEMAN Z N, ABLASHI D V, LI G, et al. Human herpesvirus 7 is a Tlymphotropic virus and is related to, but significantly different from, human herpesvirus 6 and human cytomegalovirus［J］. Pro Natl Acad Sci USA, 1992,89:10552.

［2］SECCHIERO P, GIBELLINI D, FLAMAND I, et al. Human herpesvirus 7 induces the downregulation of CD4 antigen in lymphoid T cells without affecting p56lck levels［J］. J Immunol,1997,159:341.

［3］EMERY V C. Human herpesvirus 6 and 7 in solid organ transplant recipients［J］. Clin Infect Dis,2001,32:1357.

［4］YOCCUM D E，ESPARZA L，DUBRY S，et al. Characteristics of tumor ecrosis factor production in rheumatoid arthritis［J］. Cell Immunol，1989，122：131.

［5］SAXNE T，PALLADINO M A，HEINEGARD D，et al. Detection of tumor necrosis factor α but not tumar necrosis factor β in rheumatoid arthritis synovial fluid and serum［J］. Arthritis and Rheum，1988，31：1041.

［6］KONDO K, KONDO T, OKUNO T. Latent human herpesvirus 6 infection of human monocyte/maerophages［J］. J Gen Virol,1991,72:1401.

［7］COOKE S P, RIBGY S P, GRIFFITH D J, et al. Viral studies in rheumatic disease［J］. Ann Med Internet(Paris),1998,149:30.

［8］SECCHIERO P, CARRIGAN D R, ASANO Y, et al. Detection of human herpesvirus 6 in plasma of children with primary infection and immunosuppressed patients by polymerase chain reaction［J］. J Infect Dis, 1995,171:273.