“限制酶”是高考试题中命题频率较高的知识点，也是高考备考的核心知识点。下面结合典型试题，对相关知识进行归纳和整合，希望能对广大考生的复习备考有所裨益。

一、酶切结果的推导

限制酶作为酶类，决定其催化作用具有高效性、专一性和作用条件温和等特点。其中专一性的具体表现为：某种限制酶只能催化DNA上特定序列特定位点的磷酸二脂键水解，结果是使DNA分子被分割成不同的DNA片段。限制酶所识别的双链DNA上的序列具有“回文对称”性质，即无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，即错位平切，产生的是黏性末端;当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，即平切，产生平末端。错位切的限制酶在基因工程中最常使用，因为与平末端相比较，黏性末端更有利于DNA片段的连接。

例1下面是5种限制性内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图(↓表示剪切点、切出的断面为黏性末端)：限制酶1：——↓GATC——;限制酶2：——CATG↓——;限制酶3：——G↓GATCC——;限制酶4：——CCGC↓GG——;限制酶5：——↓CCAGG——。请指出下列哪组表达正确( )

A.限制酶2和4识别的序列都包含4个碱基对

B.限制酶3和5识别的序列都包含5个碱基对

C.限制酶1和3剪出的黏性末端相同

D.限制酶1和2剪出的黏性末端相同

解析：限制酶2、3、4、5识别的序列分别包括4个、6个、6个、5个碱基对，故A、B错。限制酶1和2切割产生的黏性末端不同。限制酶1剪出的黏性末端是：—C T A G，限制酶2剪出的黏性末端是：—C A T G，限制酶3切割产生的黏性末端是:—C T A G，故D错。

答案 C

二、酶切方法的选择

构建重组质粒，需要用限制酶分别切割含目的基因的DNA片段和质粒，切割方法主要有单酶切和双酶切。单酶切是指用同一种限制酶对含目的基因的DNA和质粒进行切割，目的基因序列的两边必须各有一个能被该限制酶识别的序列及切点，而质粒至少有一个识别序列及切点，这样被切割的质粒与切下的目的基因两边形成相同的黏性末端，以实现连接而形成重组质粒，有时也可以用两种不同的限制酶(同尾酶)切割产生相同的黏性末端。双酶切是指用两种限制酶进行切割，含目的基因的DNA和质粒上都必须有能被这两种限制酶识别的序列及切点，结果两者都会产生具有两种不同的黏性末端的DNA片段，两个末端分别用A与B表示，然后混合起来，那么载体分子的A端与目的基因的A端连接，载体分子的B端与目的基因的B端连接，形成重组DNA分子，这样就可以避免DNA连接酶催化时被切割后的质粒自连成环的现象，并能保证质粒与目的基因的定向连接。

例2基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-。根据图示,判断下列操作正确的是( )

A.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割

B.质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割

C.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割

D.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割

解析：在切割质粒时应遵循一个原则：不能同时将两个标记基因切开，至少保留一个，所以只能用酶Ⅰ切割，而从目的基因两侧碱基序列可知，只能用酶Ⅱ才得到含目的基因的DNA片段。

答案：A

例3如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶,SmaⅠ的识别序列和切点是——C↓CCGGG—。下列说法错误的是( )

A.图中质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有0、2个游离的磷酸基团

B.要用PstⅠ和EcoRⅠ这两种限制酶分别去切割含抗原基因的DNA、质粒

C.对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越低

D.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来

解析:因为该质粒为环状，所以在没有经过SmaⅠ切割前，其不含游离的磷酸基团，当被SmaⅠ酶切割后该质粒变成以一条DNA分子，含有两条单链，而在每条单链的5′端会都含有一个游离的磷酸基团。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，质粒的切割也要用这两种限制酶，与只使用一种限制酶相比较，其优点在于能防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，同时确保构建的重组质粒只有一种。因为对该该质粒进行改造是只插入SmaⅠ酶切位点，相对于质粒的热稳定性而言，含有的C-G碱基对越多，则所含的氢键越多，其热稳定性越高。抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。

答案:C

三、酶切图谱的构建

酶切图谱是指选取某一特定长度的DNA分子，用多种限制酶单独或联合切割，再通过电泳技术将酶切片段进行分离，计算相对大小，以确定每一种限制酶在DNA分子中的切点位置和相对距离，并据此绘制而成的物理图谱(一般以直线或环状图式表示)。

例4用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1kb即1000个碱基对)，请在下图中画出质粒上EcoRⅤ、MboⅠ的切割位点。

解析：分析题中图解可知，用EcoRⅤ切割质粒只得到长度为14 kb的一个片段，说明该酶在质粒上只有1个切点;同理可以推测MboⅠ在质粒上有2个切点;由图中可以看出同时用两种限制酶切割时得到了3个片段，由此可以推测限制酶EcoRⅤ的切点在图中11.5 kb的DNA片段中。具体切割位点见答案。

答案：见右图：

变式训练

1.下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是( )

A.①② B.②③ C.③④ D.②④

答案：D

2.在DNA测序工作中，需要将某些限制酶的限制位点在DNA上定位，使其成为DNA分子中的物理参照点，这项工作称为“限制酶图谱的构建”。现用限制酶HindⅢ、BamHI以及二者的混合物分别降解一个4kb(1kb即1千个碱基对)大小的线性DNA分子，然后通过某种方法将获得的不同长度的DNA片段分开，结果如下图所示：

据此分析，这两种限制酶在该DNA分子上的限制位点数目是以下哪一组( )

A.HindⅢl个，BamHI2个 B.HindⅢ2个，BamHI3个

C.HindⅢ2个，BamHI1个 D.HindⅢ和BamHI各有2个

答案：A

3.图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题

(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由 连接。

(2)若用限制酶SmaI完全切割图1中DNA片段，产生的末端是 末端，其产物长度为 。

(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶Sma I完全切割，产物中共有 种不同长度的DNA片段。

(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是 。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加 的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是 。

答案:(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖(2)平 537bp、790bp、661bp (3)4

(4)BamH I 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向链接