开题报告是研究生实施毕业论文课题研究的前瞻性计划和依据，下文是小编为大家整理的关于药学毕业论文开题报告的范文，欢迎大家阅读参考!

药学毕业论文开题报告篇1

题目：梓醇对D-半乳糖拟老化神经元的作用研究

背景介绍:

随着世界人口中老年人比例和绝对数量的不断攀升，由衰老引起的人口老化相关疾病的发病率明显升高，与衰老相关的疾病已成为科学家面临的一项重要挑战。由于这类疾病常伴有严重的认知障碍及精神异常症状，甚至瘫痪和感觉障碍[1]，严重危害着老年人的健康，同时也给家庭、社会带来了沉重的负担。因此探讨脑衰老机制，研究有效的延缓衰老进程的药物，防治老年疾病己成为当今社会和医药学界研究的重大课题。

在诸多老年性疾病中，神经退行性疾病患病率逐年提高，已经成为影响人们健康水平和生活质量的重大社会问题。神经退行性疾病是中枢系统神经组织非正常退变引起的一类进行性功能缺陷与衰退疾病，如阿尔茨海默病(老年痴呆)，帕金森病，肌萎缩侧索硬化症，亨廷顿氏舞蹈症等[2-4]。其中，老年痴呆的患病率占老年人口的4.6%，其中半数为老年原发性退行性痴呆。流行病学调查也显示，在65岁以上的人群中，老年原发性退行性痴呆的发病率达2.9%。该病具有复杂的病理生理过程，受基因调控和多种环境因素影响，是一类病因学和发病机制还不清楚的疾病。临床上,对于这类疾病尚无有效控制病程进展的措施,患者最终将丧失生活能力甚至死亡。目前，我国人口老化速度居世界之首，老年人口已超过1亿，因此寻求有效的预防和治疗衰老疾病的药物迫在眉睫。

我国中药有着悠久的历史，良好的治疗效果，是中华民族传统文化的灿烂瑰宝，在几千年的实践发展中，已形成了自己独特的理论体系。特别是针对疑难病和慢性病，中医药更有它的独到之处。中药具有多靶点多效性特点，既可改善症状以治标，又可提高机体抗病能力以治本，而且副作用较少、药源丰富。中医在治疗老年性痴呆与记忆减退的数千年临床经验中积累了许多宝贵的知识。自20世纪80年代以来，由于化学药品开发所存在的技术难度高、价格昂贵、毒副作用明显和环境污染严重等实际问题，传统中医药的研究受到了广泛的关注。

地黄是常用的补益中药，为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libsch的新鲜根茎或干燥块根，始载于《神农本草经》，被列为上品[5]。地黄在我国有1000多年的药用历史，应用十分广泛，对免疫、血液、内分泌、心脑血管、神经系统及抗菌、抗炎等方面均有一定的作用[6]。单味地黄[7]和以地黄为主的复方在衰老及其相关疾病治疗中的应用历史也十分久远。现代药理学实验发现其主要的活性组分为环烯醚萜苷类和地黄糖类。

梓醇是地黄中含量最高的的环烯醚萜苷类，属于环氧醚型单萜类化合物。目前本实验室分别在细胞和动物水平上证明了梓醇具有神经保护作用，可能是潜在的延缓衰老和治疗神经退行性疾病如老年痴呆、帕金森疾病的药物。由于衰老是各种神经退行性疾病发生的根本要素，研究梓醇的抗衰老作用对预防和治疗该类疾病具有重要意义[8-9]。

实验前期发现梓醇具有改善D-半乳糖致衰老模型小鼠记忆减退的功效，同时能提高脑组织抗氧化能力和能量代谢障碍,因此本研究利用D-半乳糖引起神经元老化的模型进一步研究梓醇抗衰老的作用机制，为该药的开发和临床应用奠定一定的基础。

研究意义:

1、D-半乳糖致衰老神经细胞模型鲜见报道，明确该模型作用机制有助于利用此模型进行抗衰老药物的筛选和机理研究。

2、梓醇在衰老动物模型上的效果明显，利用细胞模型的研究有助于阐明梓醇抗衰老作用的分子作用机制。

研究内容:

采用小鼠脑神经元细胞原代培养,以D-半乳糖诱导体外神经元细胞衰老,并通过研究药物梓醇的加入对神经元细胞的作用,进行细胞形态学观察、细胞活力、细胞凋亡等综合指标的测定。

实验过程中应用细胞免疫组化染色和荧光染色技术、流式细胞仪、荧光显微镜、紫外分光光度计、荧光酶标仪等方法手段，研究梓醇在体外的神经保护作用机制。

预期达到的成果和水平:梓醇对D-半乳糖引起的小鼠脑神经元细胞衰老有保护作用.

因此本课题拟利用原代培养SD大鼠乳鼠脑皮层神经细胞，从超微结构、细胞周期分析及SA-β-半乳糖苷酶(Senescence associated β-galactosidase)化学染色等指标观察D-半乳糖培养对神经元拟老化反应并从生化方面研究梓醇的抗老化作用。

研究重点难点:

1、掌握原代神经元细胞的培养、免疫组织化学等实验技术。

2、明确D-半乳糖致神经元衰老的作用浓度和作用时间范围。

3、初步研究D-半乳糖致神经元衰老的作用机理。

4、明确梓醇对D-半乳糖致衰老神经元的作用效果。

范文二

题目：北京邮政卫生所内患者对小柴胡颗粒的认知 及使用情况

一、课题的目的与意义 二、课题研究的现状与发展趋势

三、主要研究内容

四、研究思路与方法

一、课题的目的与意义

小柴胡颗粒是传统的中成药，功效解表散热，疏肝和胃。用于寒 热往来，胸胁苦满，心烦喜吐，口苦咽干;黄疸;经期感冒等。 在医师指导下正确服用没有副作用。有不少患者认为只要是感冒 吃小柴胡就能痊愈，也有部分患者并不清楚小柴胡颗粒的功效， 还有患者患有高血压心脏病却并不知道同服小柴胡颗粒或存在危 险。所以通过此次调研了解消费者是否对小柴胡颗粒有清楚正确 的认知，这值得人们引起注意。要倡导大家合理用药。

二、课题研究的现状与发展趋势 历史背景

小柴胡颗粒是由小柴胡汤演变而来的，它的方子是：柴胡半斤、黄 芩、人参、甘草(炙)、生姜(切)各三两、大枣十二枚，半夏 (洗)半升。上七味，以水一斗二升，煮取六升，去渣，再煎取三 升，温服一升，日三服。《伤寒论》 小柴胡汤治伤寒五六日，寒热往来，胸胁苦满。不欲饮食，心烦喜 呕，口苦耳聋，脉弦数者，此是少阳经半表半里之证，以此汤和解 之《名医方论》

现代研究

现代实验研究表明，该药有保肝、利胆，解热，抗炎，抗病 原体，调节机体免疫功能，促进脑垂体 - 肾上腺皮质功能，抑 制血小板聚集和影响离体平滑肌等作用

西医临床新用

近年来有临床验证，该药还可用于很多领域，如： ①感染或炎症：慢性气管炎、支气管哮喘、急性腮腺炎合并睾丸炎、 病毒性心肌炎、前庭神经炎、慢性尿路感染。 ②发热：用小柴胡汤随症加减治疗很多发热症，如原因不明发热、 感冒、小儿夜热、胆道感染、肺炎、流感、钩端螺旋体感染、免疫 系统疾病、骨髓增生综合征等。 ③过敏性皮肤病如急性湿疹、荨麻疹、寻常性痤疮等。 ④更年期综合征。 ⑤妊娠恶阻。 ⑥原发性痛经。 ⑦传染性单核细胞增多症。 ⑧癫痫。 ⑨其他：厌食症、斑秃、胶原病、红斑狼疮、梅尼埃综合征、突发 性耳聋、急性肾盂肾炎、慢性肾变性肾炎、肾病综合征、胆囊炎与 胆石症、疟疾、 结核病、原发性血小板减少性紫癜 、 地方性斑疹伤 寒、坐骨神经痛等疾病。

中医新用

伤寒邪在少阳，此时病邪已离 太阳之表，又未入阳明之里，非汗 、 吐、下之所宜，只有和解一法适宜， 故本品为和解少阳而设。主治少阳 证， 具有清解胆热，益气和胃降逆之功 。 以往来寒热，口苦咽干，胸 胁苦满， 舌苔薄白，脉弦为辨证要点。

本品对于各种杂证，如疟疾、黄 疸、产后或经期感冒风邪，见有口苦 咽 干、目眩、往来寒热者，皆可选用。尤 其是妇人伤寒，热入血室之 症，由于妇 人感受风寒或风热之邪，正值月经来潮 或月经将净，或产 后失血，血海空虚， 外邪余热乘虚而入，与正气相搏于血 室;热入血 室而症见往来寒热，口苦、 咽干、目眩、心烦喜呕等证，本品适宜。

本品解表散热，和解少阳，风寒感冒者忌服。

对上盛下虚或肝火偏盛者，有 时服用本品后会出现头痛、目眩或齿 龈出血等症状，故不宜服。平素阴虚 吐血或肝阳上亢者，也不宜服用本 品。

本 品 服 用 后 则 表 里 和 解 汗 出 ， 有些患者由于正气较重，可能 服用本 品后会出现暂时的发热恶寒，正邪相争的寒战现象，医者应告知 患者

禁忌

1.忌烟、酒及辛辣、生冷、油腻食物。 2.不宜在服药期间同时服用滋补性中药。 3.风寒感冒者不适用。 4.有高血压、心脏病、肝病、糖尿病、肾病等慢性病严重者 应在医师指导下服用。 5.儿童、孕妇、年老体弱者应在医师指导下服用。 6.发热体温超过38.5℃的患者，应去医院就诊。 7.服药3天症状无缓解，应去医院就诊。 8.对本品过敏者禁用，过敏体质者慎用

案例

上个世纪70年代，日本的津村顺天堂捷足先登，把汉代医圣张仲景的 名方“小柴胡汤”制成了颗粒剂，成了风靡一时的治疗慢性肝炎的畅销 药。有位叫有地滋的汉方医教授写文章作报告，说用小柴胡颗粒治疗肝 炎、肝硬化“非常安全”，长期服用也没有问题。厂家、专家和媒介的 联手渲染，使得津村顺天堂几年内便发了大财出了名。对健康格外关注 的日本人趋之若鹜，不仅用小柴胡颗粒治疗肝病，就是 感冒、肺炎、 慢性胃肠炎等病，不论有无小柴胡汤适应证也都把它当 做“百宝丹” 来服用。结果就吃出了大乱子，到了20世纪90年代初， 因为滥用小柴 胡颗粒造成“间质性肺炎”的报道屡见不鲜，5年间就发生了188例， 其中22人死亡。日本厚生省专门向医师、药剂师下发了疾病的预警通告。 药没人敢吃，津村顺天堂随即破了产，社长津村昭还被判下了3年大狱。 几乎是一夜间，小柴胡颗粒整引起了关于中药毒副作用的争议。 清代名医徐大椿说：虽甘草人参，误用致害，皆毒药也。国内权威的 中医药学专家指出，所谓“小柴胡事件”的症结，并不在小柴胡汤本身， 而是由于悖离了中医博大精深的辨证论治的原则。张仲景在《伤寒论》 中都告诫后人，凡不见其主治的脉证者不能用该方治疗。日本有的汉方 医把一个中成药当成了“万金油”，不论证候，不需辨证，不分疗程， 推荐患者一个劲地吃下去，才导致这个事件。

三、主要研究内容

关于小柴胡颗粒的研究背景、现状等文献进行综述。通过查阅 文献了解人们认识及使用小柴胡颗粒时存在的问题，了解小柴胡

颗粒的未来发展趋势、市场前进如何。通过问卷调查研究该卫生

所内患者对小柴胡颗粒的认知现状及购买情况。通过对调查结果 的深入分析，进一步了解该卫生所对小柴胡颗粒功效、药理作用、 用法用量以及购买小柴胡颗粒的因素等。

四、研究思路与方法

1研究思路

先查阅相关书籍文献资料并进行整理总结，了解当前小柴 胡颗粒的发展情现状，同时结合毕业实习情况，从而确定论

文题目;而后确定调查地点为北京邮政卫生所，设计调查问

卷，进行实地预调研以及调查问卷的实地发放;回收并整理 调查问卷，统计数据;用相关软件对调查结果进行数据分析， 作为进一步撰写论文的参照，最终通过分析进一步得出结论 问卷调查。

2.研究方法

文献研究方法 在图书馆查阅相关书籍并记录、在CNKI上查找相关文献资料并 进行整理总结。 问卷调研方法 确定调查地点为北京邮政卫生所，设计调查问卷，在北京邮政 卫生所大厅首先进行10份预调研，得到结果后，根据结果对问卷 进行修正，再行实地发放问卷，问卷涉及基本信息，对小柴胡颗 粒的认知情况，影响小柴胡颗粒购买因素等内容进行调研;回收 并整理调查问卷。 数据及处理 用软件对调查结果进行数据分析，用excel做出图表;最终通过 分析进一步得出结论。

药学毕业论文开题报告篇2

题 目 名 称： 番泻叶对小鼠尿量的影响

研究现状：

一、普鲁兰酶

普鲁兰酶(Pullulanase，EC.3. 2. 1. 41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1.6糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶还可以分解普鲁兰多糖，普鲁兰酶来源于微生物，R-酶则来源于植物。普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气气杆菌Aerobacter. aerogenes}(典型菌为肺炎克雷伯氏杆Klebsiella.pneumoniae)发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能。之后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区、微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。

在淀粉加工工业中，α淀粉酶最为常用，它的功能是水解淀粉的α-1,4糖苷键，单独用它时，产物中含有大量分支结构的糊精，其中就含有大量的α-1,6糖苷键。假如不把淀粉的α-1,6糖苷键彻底分解的话，势必会造成很大的浪费。自然界中，存在有能分解淀粉的α-1,6糖苷键的酶，通称为解支酶。如寡α-1,6葡萄糖苷酶( E.C3.2.1.68, Oligo-l,6-glucosidase )，普鲁兰酶(E.C3.2.1.41Pullulanase )，异淀粉酶( E.C3.2.1.68, Isoamylose )，支链淀粉一6-葡聚糖酶( E.C3.2.1.69,Amylopectin-6-gluanohydrase )，其中普鲁兰酶要求的底物分子结构最小，故而可以将最小单位的支链分解，导致可以最大限度的利用淀粉，所以在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。故而许多国家都争相开发，但是到现在为止，只有丹麦的NOVO公司具有普鲁兰酶的生产能力。我国只有向其进口，但是其价格昂贵，限制了普鲁兰酶在我国的应用。其实，我国早在七十年代就开发普鲁兰酶的产生菌，但是该菌的酶学性质不适合生产，至今我国在普鲁兰酶的国产化方面还没有报道。

在淀粉的加工行业上，对普鲁兰酶的酶学性质的要求是耐酸耐热，其原因是因为通常使用外加酶化法，由于所用酶类的限制，普鲁兰酶的添加可以在两步反应的任何一步，但必须满足上述的反应的条件。因此所开发的普鲁兰酶的酶学性质必须满足现有的酶法水解制糖的条件，也就是耐酸耐热。

二、普鲁兰酶的研究现状

1.产普鲁兰酶的微生物

普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气杆菌(Aerobacter

aerogenes)发酵获得。他们报道了该酶的良好性能之后，各国的科研人员经过广泛深入的研究，从不同的地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。但是迄今为止，尽管发现许多微生物能够产普鲁兰酶，但是由于当今工业生产条件(酸性，温度)，大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。以下便介绍一下普鲁兰酶的生产菌种。

1.1蜡状芽抱杆菌覃状变种(Bacillus cereus Var.mycodes)

由日本的ToshiyukiTakasaki于1975年发现。该菌同时产生两种淀粉酶:β-淀粉酶和普鲁兰酶。最佳作用条件为pH6～6.5，温度50℃，最大转化率(淀粉水解产生麦芽糖)大约为95%.酶学研究中发现，此酶在pH5，温度60℃依然保持大部分活性，该菌的营养细胞呈棒杆状，聚集成长短不等紊乱链状，无运动性，格兰氏阳性，产芽抱时细胞无明显膨胀。该菌最适生长温度30℃～37℃ ,最高生长温度在41℃～45℃，可以利用葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，海藻糖，淀粉和糖原。

1.2嗜酸性分解普鲁兰多糖芽抱杆菌(BaciIluS.Acidopullulyticus)

上世纪八十年代初，丹麦Novo公司获得此菌，此菌所生产的普鲁兰酶耐热

(60℃)，耐酸(pH4.5)。该公司经过投入巨资开发研究，1983年Nov。公司在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品名Prornozyme。如今，它是应用最广，产量最大的普鲁兰酶。Bacillus.Acidopullrrlyticus呈棒状，深层发酵几小时后，可观察到类原生质体的膨胀细胞，较稳定，饱子呈圆柱体或椭圆体。格兰氏反应阳性，37℃生长良好，45℃以上和pI-1高于6.5以上不长，在以普鲁兰糖为碳源的培养基((pH4.8 ～5.2)上生长良好。

1.3枯草芽饱杆菌(Bacillus subtilis)

1986年，日本的Yushiyuki Takasaki报道了一株能产生耐热耐酸普鲁兰酶的菌种，被命名为Bacillus subtilis TU。此菌种所产生的酶为普鲁兰酶和淀粉酶的混合物，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽搪.水解普鲁兰糖为麦芽三糖，其中普鲁兰酶最佳作用pH为7.0～7.5，但在pH5.0时亦有约50%的酶活，此普鲁兰酶最佳作用温度60℃。

1.4耐热产硫梭菌(Clostridum Themosulfurogenes)

1987年.德国的E.madi等报道了一株能同时产a淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种:耐热产硫梭菌。该菌种所产普鲁兰酶有较广的温度适应范围(40℃～85℃)，在pH4.5～6.0有较高的活性，在如此广的范围内都有较强活力无疑将扩大该普鲁兰酶的应用领域.

1.5 Bacillusnaganoensis,Bacillus deramificans,Bacillus.Acidopullulyticus

上世纪九十年代，Deweer发现了普鲁兰酶产生菌Bacillus naganoensis;Tomimura筛选出Bacillus deramifrcans。这两株菌所产的普鲁兰酶的酶学性质与Bacillus. Acidopullulyticus的酶学性质相似。这两株菌都是中度嗜酸菌，在pH6.5以上就不生长，温度超过45℃以上同样也不生长。这两株普鲁兰酶产生菌的发现，进一步拓宽了普鲁兰酶的应用。

1.6产普鲁兰酶的高温菌菌种

自上世纪八十年代以来，人们逐渐意识到在通常的自然条件下，很难筛选得到极端耐热的普鲁兰酶生产菌种，于是各国的科学家便把目光转移到温泉嗜高温细菌的筛选，而且现在已经取得较多的成果。Bacillus如vorcaldarius所产普鲁兰酶的最适温度和pH分别是75～85℃, pH6.3, Thermotoga maritime的最适温度和pH分别是90℃, pH6.0, Thermurs caldopHilus的最适温度和pH分别是75℃,pH5.5, Fenidobacterion pernnavoran最适温度和pH分别是80～85℃, pH6.0o

2.普鲁兰酶的分子结构

至今为止，许多普鲁兰酶的基因己经被克隆，但是还没有见到任何有关普鲁兰酶结构的报道，但是在根据序列相似性对糖普键水解酶的分类，普鲁兰酶属于第13家族，α淀粉酶家族，这个家族中包含了30多种酶，可以分为水解酶，转移酶。异构酶三大类。这些酶能够水解和合成α～1.4,α～1.6,α～1.2,α～1.3,α～1.5,α～1.1糖苷键。其中很多酶的结构已经被报道，它们都采取了(β/α)8的结构，通过生物信息学的研究，这个家族的蛋白都有一个共同的结构，酶的活性中心都是(β/α)8折叠筒的结构，命名为结构域A。第13家族的大多数酶还具有结构域B，它是位于(β/α)8折叠筒中，第三个β片层与第三个α螺旋之间的一段序列，其特点是结构和长度差异较大，推测其功能是与底物的结合有关。在紧接着(β/α)8折叠筒后，还有C结构域，紧接C结构域，部分家族成员还有结构域D。

3.普鲁兰酶的应用

普鲁兰酶，在食品工业中是一种用途广泛的酶制剂和加工助剂。它能专一性分解淀粉中的支链淀粉和糖原分子及其衍生的低聚糖分支中的α～l, 6糖苷键，使分支结构断裂，形成长短不一的直链淀粉。因此，将该酶与其它淀粉酶配合使用时，可使淀粉糖化完全。近年来，普鲁兰酶己作为淀粉酶类中的一个新酶种，应用于淀粉为原料的食品等工业部门，在食品工业中有如下几方面的作用:

3.1单独使用普鲁兰酶，使支链淀粉变为直链淀粉

直链淀粉具有凝结成块，易形成结构稳定的凝胶的特性，因此，可作为强韧的食品包装薄膜。这种薄膜对氧和油脂有良好的隔绝性，又因涂布开展性好，故适合于作为食品的保护层。它还适合于淀粉软糖制造，也可用作果酱增稠剂，用于装油脂含量高的食品，以防止油的渗出以及肉食品加工。近年来在食品工业中提倡使用可被生物降解的薄膜，直链淀粉在这些方面具有较大的发展前途。豆类直链淀粉含量较高，因此绿豆淀粉制成的粉丝韧性比其它淀粉好，如果用普鲁兰酶处理谷物淀粉，再制成直链淀粉后，可以制成高质量的粉丝。一般谷物淀粉中，直链淀粉含量仅占20%，支链淀粉含量约为80%。工业上每生产1吨直链淀粉就有4吨副产品的支链淀粉。美国虽然通过遗传育种的方法.得到含直链淀粉60%玉米新品种，但不大适于大量生产。国外已采用普鲁兰酶改变淀粉结构，可使支链淀粉变为直链淀粉。据报道，采用此法收率可达100%.制造直链淀粉的方法为，先采用普鲁兰酶分解经液化的分支部分，使其转变为直链淀粉，并以丁醇或缓慢冷却法沉淀淀粉。再回收含少量水分的晶型沉淀物，最后通过低温喷雾干燥法制成粉状的直链淀粉。

3.2普鲁兰酶与β～淀粉酶配合使用生产麦芽搪

饴糖是我国传统的淀粉糖产品，其中所含部分麦芽糖，广泛用于糖果、糕点等食品工业。目前生产方法是以α～淀粉酶进行液化，再用β～淀粉酶水解支链淀粉，这样只能水解侧链部分。接近交叉地位的α～1.6糖苷键时，水解反应停止。但如果使用普鲁兰酶共同水解，便能使分支断裂，提高淀粉酶水解程度，降低了β极限糊精的含量，大大提高了麦芽糖的产率，有利于生产麦芽搪浆。目前对加普鲁兰酶进行糖化己作了较大规模的试验。

试验条件为。每批投料量约为900公斤碎米，粉浆浓度为15～16Be°数皮用量1.5%(对碎米计)，β～淀粉酶活性2,000单位/克以上，pH5.8;普鲁兰酶活性45,000～55,0 00单位/克，系由产气气杆菌生产，每批用量为1公斤。试验结果表明，加入普鲁兰酶糖化的试验糖与对照糖品相比，还原糖平均增加14.8，麦芽糖含量平均增加了45.6，糊精含量平均减少了26.7高浓度麦芽糖浆较之高浓度葡萄搪浆，具有不易结晶，吸湿性小的特点，所以高浓度麦芽糖浆在食品工业中有着广泛的用途。采用普鲁兰酶与p一淀粉酶配合使用，成本低廉，麦芽糖收率达到70%左右，其至更高。

3.3用于啤酒外加酶法糖化

啤酒生产中麦芽，既是酿造啤酒的主要原料，也为酿造过程提供了丰富的酶源。在啤酒酿造的糖化过程中，麦芽中分解淀粉的主要酶是α～淀粉酶、β～淀粉酶和分解淀粉α～1. 6糖瞥键的R一酶(植物普鲁兰酶或植物茁霉多糖酶)。β～淀粉酶与另两种淀粉酶协同作用，可使淀粉分解成麦芽糖(也包括少量的麦芽三糖和极少量的葡萄糖)和低分子糊精。使麦芽汁有比较理想的糖类组成。在工业生产中为了节约麦芽用量，采用所谓外加酶法糖化，即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉质辅助原料的比率，并加入适当种类的酶制剂进行搪化。要使大麦及其它辅助原料糖化完全，需要外加a一淀粉酶和分解α～1.6糖苷键的普鲁兰酶制剂等。单独使用a一淀粉酶时产生麦芽糖和麦芽三搪是很不完全的。假如分解淀粉α～1.6糖苷键的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制成的啤酒发酵度达不到要求。若采用能分解α～1.4和α～1.6糖苷键的糖化型淀粉酶，则其反应产物为葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普鲁兰酶与α～淀粉酶协同，效果良好，其分解产物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。采用外加酶法糖化时，加入酶制剂的用量为:淀粉酶6～7单位/克大麦及大米:蛋白酶，60-80单位/克，并配合以菠萝蛋白酶10ppm，普鲁兰酶50单位/克大麦。以上三种酶制剂均添加于糖化或酒化开始。

总之，普鲁兰酶无论作为酶制剂和食品工业的加工助剂均有广阔的发展前途。

研究目的和意义：

酶制剂工业是上世纪七十年代就己经形成的一个重要的产业，目前世界酶制剂总产值达100亿美元，我国的产值约为100亿人民币，并且随着其应用领域的不断扩大以及新酶种的开发，这一市场正在迅猛发展。但是全球酶制剂产业几乎被几家外国公司所垄断，其中丹麦的NOVO公司几乎占全球总销售额的一半。本研究对普鲁兰酶的开发，对酶制剂产业的发展有重要的意义。

其次我国自从七十年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发，但是所开发得到的普鲁兰酶，既不耐热也不耐酸，这就使其在工业化应用中受到了局限。为了改变我国对进口产品的依赖，填补我国这一领域的空白，寻找一条国产化的道路，本研究的目的是利用自然微生物资源，普鲁兰酶，提高我国淀粉原料的利用率，从而提高整个淀粉加工行业的生产率，这对我国淀粉加工产业的意义是不言而喻的。

研究内容(内容、结构框架以及重点、难点)：

一.普鲁兰酶产生菌的筛选

(1)样品的采集;

(2)菌种初筛;

(3)菌种复筛;

(4)菌种保藏方法;

(5)酶活力测定方法的建立。

二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究

(1)碳源，氮源对发酵产酶的影响;

(2)初始PH对发酵产酶的影响;

(3)接种量对发酵产酶的影响;

(4)发酵温度对产酶的影响;

(5)金属离子对产酶的影响。

重点或关键技术：

(1)纯菌株的分离;

(2)菌株的鉴定方法的选择。

研究方法、手段：

一.普鲁兰酶产生菌的筛选

(1)样品的采集：选择适合产生的地点(面粉厂.菜地.果园等)采集土样

(2)菌种初筛：在采集的土样用无菌水稀释后，在含有淀粉类的培养基中做平板涂步， 37℃培养48h后，用碘液进行显色反应，将有淀粉酶产生的菌落接于斜面中保存。

(3)菌种复筛：将前期分离的能产生淀粉酶的菌株涂步于普鲁兰糖平板上，37℃培养48h后用95%乙醇进行透明圈实验。有透明圈产生说明菌株产生普鲁兰酶，将产生透明圈的菌落挑于斜面培养基培养。

(4)菌种保藏方法： 采用4℃低温保藏。

(5)酶活力测定方法的建立：采用发酵培养液经过离心后利用DNS显色法 520nm测定吸光值，测定标准葡萄糖标准曲线，利用标准曲线计算普鲁兰酶酶活大小。

二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究

(1)碳源，氮源对发酵产酶的影响：采用不同碳源，氮源培养基培养一段时间，测定酶活力。(其他条件相同：接种量，装瓶量，初始PH值，转速，培养时间。)

(2)初始PH对发酵产酶的影响：采用相同发酵培养基，在不同初始PH下接种等量种子液。在相同条件下培养，测定发酵液的酶活。(其他条件相同：接种量，装瓶量，转速，最佳培养温度，最佳培养时间。)

(3)接种量对发酵产酶的影响：在发酵培养基中分别接入2%，4%，6%，8%，

10%，14%，18%的种子培养液于最佳碳源，氮源，最佳初始PH的培养基中，在相同条件下培养，分别检测酶活。(采用以上确定的最佳碳源，氮源，最佳初始PH。)

(4)发酵温度对产酶的影响：采用相同培养基，在不同温度下(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)培养一定时间，测定酶活力。

(5)金属离子对产酶的影响：在基础培养基中加入少量不同金属离子，发酵后测酶活。(金属离子有： 锰离子，钙离子，锌离子，镁离子，铁离子，铜离子。)

研究进度

：完成项目总体进度30%，样品土样的采集及前期的准备工作,菌株的初筛，包括(样品土样原液的涂步培养及摇床培养，产支链淀粉酶菌株的挑选及斜面培养)。

：完成项目总体进度50%,菌株的复筛，包括(产普鲁兰酶菌株的筛选及斜面培养),葡萄糖标准曲线的测定,酶活测定方法的建立,并以酶活大小对菌株进行再次筛选。

：完成项目总体进度80%,产酶条件的研究。包括：碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。并通过各中单因素试验确定发酵培养基的最佳碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。

2009、4—2009、5 ：完成项目总体进度100%,课题总结，撰写论文。

文献综述(包括：国内外研究理论、研究方法、进展情况、存在问题、参考依据等)

自从1961年Bender H.等人在研究一株产气气杆菌Aerobacter aerogenes(典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌Klebsiella.pneumoniae)时首次发现普鲁兰酶后，国际上对产生这种酶的微生物进行了广泛研究，发现许多微生物可以产生此酶，并筛选出一些适用于工业化生产的优良菌株。随着该酶的应用发展，对耐热性普鲁兰酶的研究也逐渐增多，已成功克隆并表达了该酶的基因。国内1976年开始对一株产气气杆菌(Aerobacteraerogenes 10016)的普鲁兰酶进行研究，对该菌株的产酶条件、酶的分离提取及酶学性质作了报道，并研究了该酶的食品级提取技术。此外，陈朝银、刘涛等人从云南温泉水样中筛选到一株产普鲁兰酶高温栖热菌菌株，通过诱导等实验将该酶的酶活从0.069u/mL提高到170u/mL，酶产量提高了近2500倍左右，酶的最适作用温度及pH分别是75℃和4.5，具有一定的耐热和耐酸特性。

陈金全等从温泉水样中筛选到一株产耐热耐酸普鲁兰酶的野生菌株，并根据形态、生理生化特征、细胞化学组分分析及16SrDNA序列比对、基因组DNA的G+C摩尔百分含量、同源性比对等实验，鉴定其为脂环酸芽抱杆菌属(Alicyclobacillus)的一个新种，所产酶最适作用温度为60℃，最适pH值4.0，具有较好的耐热耐酸特性。杨云娟等利用毕赤酵母成功构建了普鲁兰酶表达量较高的基因工程菌，摇瓶发酵酶活可达350.8U/mL，最佳发酵条件下产量可达504.5-510.1U/mL .酶的最适作用温度为600C，最适pH值4.5，具有较好的耐热耐酸性。目前我国仍没有具备独立生产普鲁兰酶能力的厂商，要实现低成本、国产化的生产，还有很长的路要走。

技术应用于耐热脱支酶的研究，使耐热异淀粉酶的研究有了很大发展。Coleman等人将嗜热厌氧菌T. brockii普鲁兰酶基因克隆到B.subtilis中得到的克隆子分泌的普鲁兰酶数量高于出发菌株，Okada等人将Bacillus Steanther, onhiu:中编码热稳定异淀粉酶的基因克隆到B.subtilu:中，得到的转化菌株其异淀粉酶能在60 ℃稳定15分钟。Burchadf将。ostridium thermosulf urogenes DSM38%的嗜热异淀粉酶基因克隆并在E.coli中表达，所得酶的最适pH和最适温度与出发菌相同，而且在高温下仍能保持活性.Antranikiam等人将Pyrococcus舟riousous的异淀粉酶基因克隆到E.coli中并分离得到了酶蛋白。尽管如此，目前尚未有已将转基因的耐热性异淀粉酶工程菌应用到工业生产中的报道。众所周知，利用物理和化学诱变剂单独或复合处理微生物细胞是选育高产变种菌株行之有效的经典方法，它在为培育多种抗生素、氨基酸、核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和淀粉酶)的高产变种菌株方面曾经起过极为重要的作用，至今仍然是方便易行和行之有效的方法之一。

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