基因科技论文范文2000字
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基因科技论文范文2000字篇一
转基因家畜的新品系培育
摘要：分析了利用现有的转基因技术所获得的G0代转基因家畜外源基因的整合和表达状况：在随机整合的情况下，存在大量嵌合体现象，不同的整合位点其表达效应不同;应用基因打靶技术实现定位整合，情况相对简单。在此基础上，提出不同整合类型对G0代转基因家畜进行遴选的方法和程序，以及建立转基因家畜纯合体的两条技术路线：一是利用遴选出的具有遗传稳定性的G0代个体，通过常规繁育获得;二是利用基因打靶技术，获得双等位基因整合(或敲除)的家畜。最后根据家畜育种的理论，提出了建立转基因新品系、进而形成新品种的步骤。
关键词：转基因家畜;纯合体;新品系
中图分类号：S813.3文献标识码：A文章编号：0439-8114(2011)18-3785-05
The Breeding of Transgenic Livestock New Lines
WEI Qing-xin，ZHENG Xin-min
(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science ，Hubei Academy of Agriculture Sciences/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding， Wuhan 430064，China)
Abstract： The integration and expression of foreign genes in the G0 transgenic livestock’s which obtained by using existed transgenic technology were first analysized. There were a lot of chimerism in the cases of random integration， and the expression effects were also different in different integration sites. It should be relatively simple if targeted integration was achieved by gene targeting technology. On this basis， the methods and procedures of the selection for G0 transgenic animals in different integration types were proposed， and two technical routes for homozygous transgenic animals were established. The first one was to select genetic stable G0 individuals and obtain homozygote through conventional breeding. The second one was to repeatly use somatic cell gene targeting to obtain the livestock with dual-allele interaction (or knockout). Finally， according tothe livestock breeding theory， the proncess of constructing a new trangenic line and then forming a new species based on the transgenic homozygous individuals was put forward.
Key words： transgenic livestock; homozygotes; new lines
应用现有的转基因技术制备出转基因家畜个体，再到培育成一个转基因新品系、进而培育成新品种，还有大量的选育工作要做和相当长的育种路程。无论用哪一种转基因方法得到的原代转基因家畜(G0代，由转基因的胚胎发育成的转基因动物[1])，都只是育种的初始材料，有的还不能作为育种的材料。G0代转基因家畜能否作为育种材料，取决于其外源基因遗传的稳定性，以及其表达水平是否达到预期要求。而G0代转基因家畜遗传稳定性以及表达水平，则与外源基因整合的位点和整合的状况有关。按目前的转基因技术，G0代转基因猪外源基因一般只是整合在同源染色体中的一条染色体上，可称其为“杂合体”。只有获得“纯合体”(同源染色体上的相同位点都整合有外源基因)，才能进行下一步的建立家系、品系等育种工作。在建立转基因品系的过程中，还要兼顾其他经济性状的选育。可见，从转基因家畜个体到培育成转基因新品系，是分子选择与常规育种相结合的过程。
本研究提出建立转基因家畜新品系的方法和步骤，仅供参考。
1外源基因在G0代转基因家畜中的整合状况
目前的转基因技术，外源基因的整合有两种情况：一种是随机整合;另一种是定位整合。外源基因的定位整合，一般是通过基因打靶技术实现的。
1.1随机整合
1.1.1转基因动物的嵌合体现象所谓转基因动物嵌合体是指：转基因动物由转基因的和非转基因的两种细胞、或由两种或两种以上不同类型的转基因细胞构成[1]。下列几种情况，有可能导致转基因嵌合体的产生：其一，与外源基因整合的时机有关，如果胚胎或细胞导入基因的时机染色体已经复制，则形成嵌合体的可能性较大。其二，对两个细胞期以上的胚胎进行基因导入，例如对两个细胞期的胚胎进行外源基因的显微注射，多数会形成嵌合体。其三，在胚胎细胞的分裂和分化过程中，一部分插入DNA被修饰，也会形成嵌合体。有研究表明，应用显微注射的方法进行转基因，嵌合体的比例大约占65%左右[2，3]。在转基因嵌合体中，如果生殖细胞中有外源基因的嵌合，则可以将转基因传递给后代;否则，就不能将转基因传递给后代。这就是有些G0代转基因动物不能传代的原因之一。
1.1.2外源基因的整合位点及其效应非基因打靶的外源DNA导入受体细胞后将随机地插入受体基因组中的任意位置[1]。牛迄东等[4]用地高辛标记探针对3头G0代转pGH猪染色体进行原位杂交，结果表明，其外源基因分别定位在7q14、6p12、8p22上。陈付学等 [5]应用非同位素原位杂交技术，研究转基因猪外源hDAF基因在受体基因组染色体上的整合及其定位，结果表明，6头G0代转hDAF猪外源基因分别定位在2p、6p14、7p11、7q26、11q12和13q44上。这些试验结果可以说明，不同的G0代个体外源基因的整合位点不同，显示出其随机性。
转基因的表达与其整合位点有关，不同的整合位点，表现出不一样的表达效果，称之为转基因的“位点效应”。朱作言等[6]将转基因的“位点效应”分为三种类型，即“有效整合”、“沉默整合”和“毒性整合”。转基因的有效整合位点应具备两个特征：其一，转基因能有效表达;其二，避免干扰基因组功能基因的表达调控或破坏基因结构。无表达作用的整合为“沉默整合”，其整合位点常发生在染色体异染色质区。“毒性整合”的位点一般在常染色区，由于干扰了基因组功能基因的表达调控或破坏了正常基因的结构，而导致胚胎或个体生长发育受阻、畸形甚至夭折。
有效整合的位点具有遗传的稳定性。樊俊华等[7]对来自同一G0代亲本的G1、G2、G3代转PGH基因猪，采用非同位素标记的染色体原位杂交技术进行了定位检测，结果表明，外源基因均定位于13q12上。表明能够传代的G0代转基因动物，其后代的整合位点是相对稳定的。
1.1.3外源基因的整合形式外源基因随机整合的形式有三种：单拷贝单一位点整合，多拷贝串联单一位点整合，多拷贝多位点整合。多拷贝整合，外源DNA通常呈现多串状整合;在绝大多数情况下，某一位点上多拷贝串状整合的外源基因，采取头尾相连的排列方式;这些方向一致的串状拷贝，是被导入DNA的完整或近乎完整的拷贝，少数情况下也有在两个相邻拷贝结合的地方出现小的不完整;在稀有的情况下，发现两个拷贝呈现头对头或尾对尾的连接方式，在这种情况下常发生末端缺失[1]。转基因的另一种变化是某些碱基被甲基化。转基因拷贝的不完整、末端缺失或甲基化，都会影响基因表达和遗传的稳定性。多拷贝串联的拷贝数可从几个到100个以上。Hammer等[8]以定量斑点杂交法，检测转基因猪整合外源基因的拷贝数，发现整合MT-hGH基因拷贝数在1～490个，整合MT-bHG基因拷贝数在1～28个，整合MT-hGRF基因拷贝数在30～100个。孔庆然等[9]采用定量 PCR 技术，检测了两头体细胞核移植技术生产的绿色荧光蛋白转基因猪，其外源基因拷贝数分别为(30.85±1.77)个和 (18.87±1.34)个。
已有的转基因动物研究，尚未见转基因拷贝数与表达水平之间具有很明确相关性的报道。但这是需要进一步深入研究的问题。
1.2定位整合
外源基因的定位整合一般是通过基因打靶实现的，基因打靶是精确地人工修饰基因组的一种技术。这种技术的特征在于：第一，具有直接性，直接作用于靶基因，不涉及基因组的其他位置;第二，具有准确性，可以将设计好的DNA序列插入选定的目标基因座，或者用设计好的DNA序列去取代基因座中相应的DNA序列。因此，通过基因打靶技术制备的转基因动物，应不存在转基因的嵌合体现象，其整合位点和拷贝数也应是确定的。
对于家畜而言，实现外源基因的定位整合(或基因敲除)，必须通过核移植的程序。目前体细胞核移植生产克隆家畜的效率很低，大量的重构胚在孕育期死亡，出生后的个体生长发育不正常、甚至死亡的频率也很高。这些情况，应主要是由于克隆技术不完善而导致的;但也不能排除一部分是由于外源基因(或敲除基因)的表达或整合位点的不当所致。
2G0代转基因家畜的遴选
了解了外源基因在G0代转基因家畜中的整合和表达状况，就不难理解要进行定向育种，就必须对G0代转基因个体进行遴选。
2.1遴选的内容和目标
G0代转基因家畜是建立新品系的原始材料，遴选正确与否，将决定今后育种工作能否进行下去。选择内容应包括如下几点：①G0代转基因家畜的生长发育、繁殖性能是否正常;②外源基因的表达是否达到预期;③外源基因整合和表达水平是否具有遗传稳定性。
最终的遴选目标应是：生长发育和繁殖性能正常，外源基因的表达水平达到预期，且具有遗传稳定性的个体。
2.2遴选程序
2.2.1G0代生长发育、繁殖性能和生理生化指标的测定和评价对所有G0代个体按家畜育种的常规进行饲养管理(有些种类的转基因家畜也许需要特殊的饲养管理)并观测其生长发育和繁殖性能，在规定的日龄进行生理生化指标的检测，重点观察有无异常或其他的病理表现。所有测定和检测，均应以同窝非转基因家畜或亲本品种的成绩作为对照。
2.2.2G0代转基因家畜的表达检测对生长发育、繁殖性能和生理生化指标正常的G0代转基因家畜，进行转基因的表达检测。表达检测的程序，应首先进行转录(mRNA)水平的检测，然后进行翻译水平(蛋白质水平)的定性和定量检测，有些还要进行生物活性的检测、功能测试和性能测定。从而选择出达到预期表达水平的G0代转基因个体。
2.2.3G0代个体遗传稳定性测定测定G0代转基因个体的遗传稳定性，需进行繁殖传代，从后代的检测情况进行判断。
对于随机整合的转基因个体，繁殖传代应采取如下方式：雄性G0代个体应与非转基因的雌性个体进行交配，雌性G0代转基因个体应与非转基因雄性个体交配。按照这样的交配方式，从理论上，遗传稳定的G0代个体，其后代的阳性率应为50%。实际操作中，在后代个体数不少于30个样本的情况下，接近50%即可，样本量越大，越应接近50%。切忌G0代不同性别个体之间的交配，因为每头G0代个体整合的位点不一，表达水平不同，同时还存在转基因嵌合体的可能，这种交配方式所产生后代的检测结果无法说明任何一个亲本的遗传性。
对于定位整合技术制备的G0代转基因个体，应首先进行外源基因的定位检测，以判断其是否按照预期整合到相应的位点上;同时进行表达检测，定位整合的G0代个体其表达水平应该是基本一致的，但允许有一定的差别(同位点、相同拷贝数的整合，由于个体之间的差异，也会出现表达水平的差别)。即使整合与表达的检测都达到了预期的G0代个体，也必须通过传代来判断其是否具有遗传的稳定性。其繁殖传代的方式可有两种：一种方式如前所述，即G0代转基因个体与非转基因个体进行交配，如后代的阳性率50%左右，且G1的表达水平基本达到了转基因亲本的水平，即可初步认为该G0代转基因个体具有遗传稳定性;另一种方式，即两头具有不同性别的G0代个体之间的交配，其产生的子代(G1)如果阳性率为75%左右，就可以初步认为该两头G0代个体均具有遗传稳定性。
最终判定G0代转基因个体的遗传是否稳定，还有赖于由该G0代所产生的G1、G2，甚至于G3、G4代的检测结果。
3转基因家畜纯合体的建立
建立转基因家畜的纯合体(或纯合子)可有两条路线：一是利用遴选出的具有遗传稳定性的G0代个体，通过常规繁育获得;二是利用体细胞二次基因打靶，获得双等位基因整合(或敲除)的家畜。第一条路线耗时长，而且还有近交风险;第二条路线可一步到位，但技术难度大。
3.1通过常规繁育建立转基因纯合体
3.1.1随机整合转基因纯合体的获得随机整合的情况下，G0代个体之间整合的位点不一，整合的拷贝数不同，表达水平也有差别。如果不同性别的G0代个体之间进行交配，无法得到双等位基因整合的后代，因此也就不能得到转基因纯合体。只有G0代个体与非转基因个体交配所产生的G1代，其整合的位点、整合的拷贝数和表达水平才会是一致的;进而进行G1代之间的交配，在近交所产生的G2代中，才能筛选出转基因纯合体。其近交的方式可有如下两种。
全同胞近交：交配模式如图1所示。
在图1的交配模式中，G2代转基因个体的比例应为总产仔数的75%;而在G2代转基因个体中，纯合体应占1/3。
半同胞近交：除个别作为试验动物用的动物外，作为商业生产的家畜品种，并没有严格生物学意义上的近交系。非近交系的家畜实行近交，会出现近交衰退的现象。近交的程度越高，近交衰退的现象也就越严重。为了降低近交衰退的风险，可采用半同胞近交，交配模式如图2所示。图2的交配模式，G2代转基因个体中纯合体亦应占1/3。
3.1.2定位整合转基因纯合体的获得应用定位整合技术所获得的G0代转基因个体之间，由于其整合位点、整合拷贝数相同，表达水平也基本一致，因此可以直接用不同性别相互交配的方法得到纯合体。如图3所示。在图3的交配模式中，G1代转基因个体的比例应占总产仔数的75%，而纯合体应占G1代转基因个体的1/3。
3.1.3转基因纯合体的鉴定与筛选上述无论哪一种交配模式，都需要将纯合体从转基因的群体中筛选出来。鉴定纯合体的方法有两种：第一种是实验室方法，近年来发展建立了一些纯合体转基因动物鉴定的实验室方法，如荧光原位杂交法(FISH)、Southern杂交法和荧光实时定量PCR法等。这些方法已成功地应用于转基因小鼠纯合体的筛选。第二种是常规繁育法，实验室方法的检测结果只能作为参考，最终确认纯合体还必须通过常规繁育的方法。转基因个体与非转基因个体交配，如果其后代100%是转基因的，就可以确认该转基因亲本是纯合体;否则其转基因亲本仍然是“杂合子”。
3.2通过基因重复打靶技术建立转基因家畜纯合体
通过常规繁育技术建立转基因家畜纯合体耗时很长。以猪为例：猪的世代间隔为1年左右，如前所述，随机整合的G0代转基因猪通过两个世代的繁育，加上鉴定纯合体的一个世代，至少需要3年的时间才能最终筛选出纯合体;即使是定位整合的G0代转基因猪，至少也需要2年的时间才能最终筛选出纯合体。对于牛等世代间隔长的家畜，其所耗费的时间就更长。体细胞的基因重复打靶技术为解决上述问题提供了可以一次到位的技术路线。Kuroiwa等[10]对牛成纤维细胞进行PRNP基因的打靶，并通过克隆技术构建重构胚，重构胚移植到子宫内发育成75日龄的胎儿实施流产并再次分离其成纤维细胞;然后进行重复打靶获得纯合型基因敲除细胞，以纯合型基因敲除细胞作为核供体，构建成PRNP双等位基因位点失活的转基因牛。
体细胞基因重复打靶的关键技术有两点：一是要利用目标基因及其相邻序列，构建A和B两种基因打靶载体，分别用于敲除两条姊妹染色体上的目标基因拷贝;A、B两种载体分别用不同的标记，如GFP和RFP，防止两种标记基因相互干扰。二是要建立“细胞拯救技术”。在体细胞上实施基因打靶的制约因素，是细胞寿命太短。由于细胞增殖的代数有限，往往是尚未确定是否实现了靶向基因交换，细胞就进入凋亡期，难以把细胞还原成动物个体。但是，体细胞经过核移植过程之后，可以重新启动发育程序，其寿命得到更新。根据这个原理，在两轮基因打靶之间引入细胞拯救过程，使第一轮基因打靶中的阳性细胞得以更新。这一技术步骤能将细胞团扩增为胎儿组织，生产大量均质的细胞，这些细胞不仅可以满足进一步分子检测需要，同时为完成第二轮基因打靶争取到足够的时间。
完成两次基因打靶核移植出生的后代，应该全部是双等位基因整合(或敲除)的纯合体。但最终的确认还是要通过实验室检测和常规繁育的方法，转基因个体与非转基因个体交配，如果其后代100%是转基因的，就可以确认该转基因亲本是纯合体。
4转基因家畜新品种的建立
得到遗传稳定的转基因纯合体家畜后的工作便是进入常规育种的程序。为了监测外源基因在进入常规育种传代过程中是否丢失或变异，需要对后代逐头进行分子检测。
4.1转基因新品系的建立
建立转基因新品系，可采用系祖建系法，即以经过筛选的纯合体为系祖建立品系。以猪为例：猪的品系群最低应不少于6个血统的6头公猪和30～40头母猪所组成[11]，形成这样的一个遗传稳定、表达水平基本一致的群体，就可以认为转基因猪新品系建立成功。
4.1.1随机整合转基因家畜新品系的建立随机整合的转基因家畜个体之间，外源基因整合的位点和拷贝数不一致，如果用来源不同(G0代不是同一个体)的纯合体之间交配，所得到的后代又成为新的杂合体。因此，只能采用同一来源(G0代为同一个体)的纯合体之间交配，才能保证后代的纯合性和遗传稳定性。这就增加了建系的难度，过高的近交系数会导致群体的衰退，生命力下降，有的或许难以为续。因此，在建立纯合体的过程中，一是要尽可能采用半同胞近交的方式;二是选择的非转基因个体与G0代转基因个体之间，以及非转基因个体之间，应尽量避开血缘关系。
以来源于同一头G0代转基因家畜的若干纯合体(G2代)，经各种性状的选择之后，首先建立若干个家系。在建立家系的过程中，设计公、母畜之间的交配组合，也要尽量降低近交系数。在建立家系的基础上，按育种计划的数量，选择其中优秀的公、母畜个体，进行纯繁扩群，建立核心群，进而形成品系。
4.1.2定位整合转基因家畜新品系的建立应用定位整合技术制备的转基因家畜，其新品系的建立比随机整合要简单、易行。无论来源是否相同(G0代是否为同一个体)的纯合体，其交配的后代都是纯合体。这就可以容易地避开血缘关系，降低或防止近交衰退。
如果是应用重复打靶技术获得的纯合体转基因家畜，从G0代就可以进行选择并建立家系的工作。
从不同整合类型转基因家畜新品系建立的过程中，可见定位整合乃至于双等位基因整合对于转基因育种的重要性;同时启示我们，如果出于育种的目的制备转基因家畜，从一开始就应考虑后期育种工作的复杂性，从而选择合适的转基因技术路线。
4.2转基因新品种的建立
我国猪育种工作者认为，一个猪的品种，至少应有3个以上的品系。每个品系之间应有不同的品质[11]。对于转基因猪的所有品系而言，转基因所表达性状的品质应该是共同具备的。而品系之间品质的不同，则可以从以下几方面体现：①以制备转基因猪时所用不同亲本的品系为基础，建立若干个转基因品系;②以转基因性状表达水平的差异，建立若干个品系。③随着转基因品系扩繁规模的扩大，会逐步分布在不同的地区和不同的饲养场。不同的地区或不同的饲养场，其饲料结构、自然条件、饲养管理方法的不同，会形成若干各具特点、互有差别(这些特点或差别应主要体现在常规性状上)的类群，从而形成若干新的品系。
至今尚未见任何一种转基因家畜新品种培育成功的报道，其过程也许比本研究描述的这些要复杂、困难得多，会有许多现在还预料不到的事情发生。只有在今后的育种实践中，不断探索、总结和完善，形成转基因家畜育种的新的理论和方法。
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