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高中生物单克隆抗体实验总结

(一)动物的选择

目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。就品系而言以Balb/c小白鼠应用最广，由于所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。

大白鼠也可，能产生较多量的单抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠-大鼠，小鼠-人以及人-人杂交瘤技术。

(二)免疫

一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。

免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单抗体的关键之一。

正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.0×107~5.0×107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了进步得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。

B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人以为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，固然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般以为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。

1.可溶性抗原(蛋白质) 以1mg/ml～5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔3～5周再同样注射一次，10天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉(尾静脉)给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，3～4天后，杀死小鼠取脾做融适用。

2.颗粒性抗原 如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以1%浓度每只皮下注射0.2ml，每周2次，共免疫5～8次，取脾前3天，再免疫一次即可。有人以为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。

单抗技术是主要由抗原制备，免疫动物，细胞融合，筛选杂交瘤细胞，克隆化培养，单克隆抗体的大量制备与鉴定等一系列实验组成的实验系统，其核心部分是细胞融合。细胞融合是单克隆抗体技术的中心环节，基本步骤是将脾细胞和骨髓瘤细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。

实验原理:B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂;而骨髓瘤细胞可以在体外无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后，用一特殊选择培养基(HAT)阻断正常细胞或自体融合细胞的DNA合成通路，而杂交瘤细胞可利用补救通路合成DNA得以生存，且既能产生抗体，又能无限增殖，并以此生产抗体的技术。

实验方法

材料：Balb/c小鼠，SP2/0骨髓瘤细胞，50%PEG，不完全培养液，HAT培养液，75%酒精，剪刀，镊子，纱布，离心管，网筛，大小瓶 皿，直头滴管，弯头滴管，瓶塞，培养瓶盖，离心管盖，烧杯(加入37℃水)，泡沫板，大头针，96孔培养板，计时器，显微镜，计数板等。

单克隆抗体技术方法：

显微镜下观察血片或骨髓片，找出异常细胞。

(1)饲养细胞的制备

1.常用Balb/c小鼠，拉颈处死，浸泡于75%酒精内，3～5min。

2.用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，剪一小口，用滴管注入5～6ml不完全培养液(严禁刺破肠管)。

3.反复冲洗，将冲洗液吸入15ml离心管，1000rpm5min离心，用完全培养液混悬，调整细胞密度。

(2)SP2/0骨髓瘤细胞的制备

1.选取状态良好、处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞。

2.弃去原瓶中培养上清，用不完全培养液冲洗三遍。

3.再以不完全培养液对细胞进行充分吹打，得到的细胞悬液移入15ml离心管。

4.细胞计数。

(3)脾细胞的制备

1.3天前加强免疫的小鼠，摘眼球取血后，拉颈处死，75%酒精浸泡3～5min。

2.将小鼠固定于泡沫板上，打开腹腔，取出脾脏，用不完全培养液反复冲洗。

3.在平皿中的网筛中，用镊子夹取脾脏进行反复研磨，边磨边滴加不完全培养液，直到脾细胞单个化，将细胞悬液转入15ml离心管中。

4.细胞计数。根据两种细胞计数结果，调整悬液用量，配平之后(SP2/0细胞与脾细胞数量比值在1：5～1：10之间)，以1000rpm5min离心。

5.弃上清，每管加入5ml不完全培养液，吹打混匀后合并于同一15ml离心管中，再次以1000rpm5min。

6.离心，弃上清，用滴管吸净残留液体。

(4)细胞融合

1.前面步骤所得到的细胞沉淀，轻弹离心管管底，使其呈糊状。

2.在37℃水浴中，轻轻振荡，一边缓缓加入1mlPEG，边加边摇，PEG于1min内加完。

3.加完PEG之后，将悬液在37℃水浴中静置1min。

4.继续在37℃水浴中，边摇边加入不完全培养液2ml，于2min内加完。

5.慢慢加入不完全培养液，800rpm，8min。

6.弃上清，加入含1%HAT、20%FCS的培养液，轻轻混匀。

(5)在96孔细胞培养板中加入饲养细胞上清，1滴/孔;之后加入融合细胞悬液，1滴/孔。

(6)镜下观察96孔板中细胞情况，CO2孵箱中培养。

单克隆抗体技术实验结果计算:一只小鼠可获得(1～2.5)×108个脾细胞，与(2～3)×107个SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。显微镜下可见单个分散的细胞，细胞培养3～5天后即可出现小克隆，杂交瘤细胞较大，呈圆形且透明，其它细胞透光性差并逐渐死亡。